О ПОРОДЕ :

НОВОЕ В ДИАГНОСТИКЕ МЕДНОГО ТОКСИКОЗА (СТ)
Часть 1

На главную

© Надежда Писарева, кинолог, питомник "Cоло России"
(добавлено 01.07.2009)

 

Напомню, что Медный токсикоз (СТ) представляет собой наследственное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, проявляющееся преимущественно в молодом возрасте и характеризующееся избыточным накоплением меди в печени, которая в больших количествах становится токсичной для организма животного. Считается, что СТ обусловлен единственным рецессивным геном и его распространение полностью подчиняется законам Менделя.

Доминантный («нормальный») ген условно обозначим буквой «С».
Рецессивный («дефектный») генбуквой «с».

Возможные генотипы будут выглядеть следующим образом: Генотип «СС», т.е. «здоровый», означает, что данная особь не несет в своих хромосомах рецессивного гена СТ. Собака с таким генотипом никогда не заболеет СТ и передаст своим потомкам только «чистый» от СТ набор хромосом. Такая собака не нуждается в специальной диете и лечении.
Генотип «Сс», т.е. «носитель», означает, что данная особь является носителем гена СТ и может передавать этот ген своим потомкам. Собака с таким генотипом не может заболеть СТ сама, ей не требуются специальная диета и лечение.
Генотип «сс», т.е. «больной», означает, что данная особь получила ген СТ либо от обоих родителей «носителей» гена СТ (оба родителя с генотипом «Сс»). Либо - от «больного» / «больных» родителей (с генотипом «сс»).

Генотип - совокупность всех генов, локализованных в хромосомах данного организма (совокупность всех наследственных факторов организма).
Генотип — носитель наследственной информации, передаваемой от поколения к поколению. Он представляет собой систему, контролирующую развитие, строение и жизнедеятельность организма, т. е. совокупность всех признаков организма — его фенотип. Взаимодействие Г. с комплексом факторов внутренней и внешней среды организма обусловливает фенотипическое проявление признаков. В общем виде правильнее говорить, что Генотип определяет наследование не конкретных признаков, а норму реакции организма на все возможные условия среды.
Генотип не всегда соответствует одному и тому же фенотипу. Некоторые гены проявляются в фенотипе только в определенных условиях. С другой стороны, некоторые фенотипы, например, окраска шерсти животных, являются результатом взаимодействия нескольких генов.
Примером различия генотипа и фенотипа служит наследование СТ. Иногда в семье, в которой оба родителя здоровы, рождается больной щенок. То есть, хотя болезнь не проявилась в фенотипе родителей, в их генотипе присутствовал один нормальный аллель и один мутированный аллель гена, то есть они являлись носителями заболевания. В данном случае фенотип здоровых собак и носителей заболевания одинаков.

Термин «генотип» часто употребляют в более узком смысле для обозначения лишь группы генов или даже отдельных генов, наследование которых составляет предмет наблюдения. Например (в нашем случае), в расщепляющемся потомстве от моногибридного скрещивания СС (генотипы СС, Сс и сс, отвлекаясь от возможных различий между соответствующими особями по др. генам).

Гены представляют собой линейные полимеры ДНК, соединенные в длинные цепи, которые вместе с белками хроматина образуют хромосомы. В норме все ядерные клетки собаки, кроме сперматозоидов и яйцеклеток, содержат 78 хромосом, составляющих 39 пар. В каждой паре одна из хромосом унаследована от одного родителя, а другая - от второго.

50% генетической информации унаследовано от отца, 50% - от матери.
Происходит это при образовании гамет, т.е. половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток – при мейозе. Во время мейоза хромосома (состоящая из двух хроматид) тесно переплетается своими частями с другой, гомологичной ей хромосомой (также состоящей из двух хроматид), и происходит кроссинговер - обмен гомологичными участками хромосом.

Уже новые хромосомы с перемешанными «материнскими» и «отцовскими» генами расходятся, и образуются клетки с диплоидным (двойным) набором хромосом.
Состав этих хромосом уже отличается от исходного, в них произошла рекомбинация.

Завершается первое деление мейоза, и второе деление мейоза происходит без синтеза ДНК, поэтому при этом делении количество ДНК уменьшается вдвое. Из исходной 1 (одной) клетки с диплоидным (двойным) набором хромосом возникают 4 (четыре) гаметы с гаплоидным (одинарным) набором.

Подробнее здесь

В результате мейоза у отца и матери (применительно к рассматриваемому вопросу о наследовании СТ) образуются следующие гаметы:

Таблица 1
У отца планируемых щенков будут образованы следующие гаметы:

Генотип ОТЦА щенков (здоровый)
1-1
a-c
Гаметы (сперматозоиды)
1
a
 
1
c

Таблица 2
У матери планируемых щенков будут образованы следующие гаметы:

Генотип МАТЕРИ щенков (носитель)
1-2
b-c
Гаметы (яйцеклетки)
1
b
 
2
c

Итак, сперматозоид проник внутрь яйцеклетки, и восстановился диплоидный набор хромосом (50% от папы и столько же от мамы), дав начало НОВОМУ организму со своим УНИКАЛЬНЫМ набором хромосом, что так отличает индивидуумы, как по генотипу, так и по фенотипу.

Таблица 3

Варианты генотипа щенков
1- 1
здоровый
1- 1
здоровый
1- 2
носитель
 
Варианты генотипа щенков
a- b
здоровый
a- c
здоровый
c- b
носитель
c- c
носитель

Расщепление в малых пометах носит случайный характер, классическое менделевское расщепление можно получить на сравнительно большом числе наблюдений, более 100 (ни один кобель, ни одна сука тем более, такого количества щенков за всю свою жизнь не произведут). В конкретных пометах от такой пары могут быть все щенки здоровыми, либо все щенки будут носителями, либо будут и здоровые/носители

В большинстве генов человека, и собаки в том числе, кодирующая последовательность разделена на сегменты (экзоны), между которыми находятся некодирующие последовательности (интроны).

Таблица 4
Схематично это будет выглядеть так (гаплотип «А»):

И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э

Таблица 5
У здоровых собак оба аллельных гена не изменены,
гомозиготная особь (генотип «СС», «дикий тип»)

И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э

Группа ученых из Нидерландов (Van De Sluis B et al, 2002) провела картирование гена СТ у бедлингтон терьеров. Ген был локализован на хромосоме 10 (10q26), установлена протяженность гена: < 500 kb. Оказалось, что в обоих аллелях больных животных и в единственном аллеле, обязательно присутствующем у носителя заболевания, отсутствует (делеция) экзон 2 в гене MURR1, а именно отсутствие 94 аминокислот.
Это открытие имеет особое значение для разделения больных собак от носителей заболевания и здоровых собак.

Таблица 6
Схематично это будет выглядеть так (гаплотип «В»):

И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э

Таблица 7
У носителя заболевания СТ оба аллеля разные - аллель «дикого типа» и мутантная аллель, -
гетерозиготная особь (генотип «Сс», мутация в одной аллели):

И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э

Таблица 8
У больной СТ собаки оба аллеля на гомологичных хромосомах изменены,
гомозиготная особь (генотип «сс», мутация в обеих аллелях):

И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э
И
Э

*) Аллель - одна из возможных форм одного и того же гена. Аллели расположены в одинаковых участках (локусах) гомологичных (парных) хромосом; определяют варианты развития одного и того же признака, контролируемого данным геном. Новые аллели (их число практически неограниченно) возникают в результате изменения структуры гена - мутации.
Распространённые в природных популяциях аллели, обусловливающие развитие признаков, характерных для вида, называют аллели «дикого типа», а происходящие от них аллели — мутантными
. Если два аллеля одинаковые, то индивидуум является гомозиготным для такого гена; если различные - то гетерозиготным.
Любое изменение структуры гена в результате мутаций или за счёт внутригенных рекомбинаций у гетерозигот по двум мутантным аллелям приводит к появлению новых аллелей этого гена.

**) Делеция - тип хромосомной аберрации (перестройки), в результате которой утрачивается часть генетического материала, - выпадение участка хромосомы из ее интерстициальной части (от нескольких нуклеотидов до визуально идентифицируемых на хромосомных препаратах фрагментов). Делеция может быть следствием разрыва хромосомы или результатом неравного кроссинговера)

***) Экзон - участок гена, несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоны разделены некодирующими участками – интронами.

****) Гаплотип (сокр. от «Гаплоидный генотип») — генетическая комбинация генов на одной хромосоме. Гаплотип может быть как у одного локуса, так и у целого генома. У диплоидных организмов, к которым относится и собака, гаплотип целого генома содержит половину диплоидного генома — по одному члену из каждой пары аллелей для каждого локуса.

В малой популяции, где скрещивание проходит между близкородственными особями, пропорция аллелей изменяется относительно быстро.

Эти гены наследуются по кодоминантному типу - у потомства в одинаковой степени экспрессируются (перенос генетической информации от ДНК через РНК к полипептидам и белкам) гены (аллели - варианты гена), полученные от каждого из родителей. Комбинация аллелей из разных локусов на одной хромосоме, названная гаплотипом в связи с их тесным сцеплением, наследуется блоком. В редких случаях кроссинговера наследование блоком нарушается и образуется рекомбинантный гаплотип.

Несколько позднее теми же авторами в американской популяции бедлингтонов был обнаружен еще один гаплотип – «С»
Гаплотип «С», по сообщениям, этих же авторов, никогда не выявлялся в поголовье бедлингтон терьеров Голландии и Великобритании.

Иллюстрация находится здесь

Комментарии к рисунку:
(A) Гаплотипы Бедлингтон терьеров с американской родословной.
Здоровые (unaffected) особи обозначены незаполненными символами, носители (carriers) обозначены полузаполненными символами.
(B) Различные гаплотипы, которые можно отличить, используя маркеры в пределах гена MURR1, маркера C04107, экзона 2 мутации, и SNP-B
На представленном рисунке расстояния между интронами и экзонами опущены

таблица 9
Гаплотипы и типы маркеров

 
Интрон 1
Тип маркера С04107
Экзон 2
MURR1
Интрон 2
Тип маркера SNP-B
Гаплотип
 
 
 
"А"
1
" дикий тип"
1
"В"
2
Д экзон 2
2
"С"
2
" дикий тип"
2

Непрямой генетический метод ДНК-тестирования (микросателлитный)

Исторически более ранней методикой ДНК-тестирования является методика, разработанная в лаборатории Dr. George Brewer, Университет в Мичигане, проверивших более 200 генетических маркеров. Этот маркер "сопровождает" дефектный ген, - он не является его частью. Таким образом, данный тест "работает" иначе, чем тесты, где генетический дефект определен. Так, как это имеет место в диагностике СТ по вышеописанной методике. Его можно использовать в качестве генетического маркера как для косвенной ДНК-диагностики СТ в пораженных линиях, так и для характеристики генетической структуры популяций.
В гене СТ описаны микросателлитные повторы ("С04107", как диагностический маркер СТ в популяции бедлингтон терьеров Дании, 2000г.).

*) ДНК-маркеры - это особенности нуклеотидной последовательности ДНК, отличающиеся полиморфизмом и тесно связанные с геном, отвечающим за нужный признак.

Маркеры на основе ДНК-зондов:
RFLP (ПДРФ-маркеры) - Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов;
VNTR - Variable Number Tandem Repeat, минисателлиты.

ПЦР-маркеры (ДНК маркеры):
RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA;
AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism;
SSR - Simple Sequence Repeats, микросателлиты;
ISSR - Inter Simple Sequence Repeats;
SNP - Однонуклеотидный полиморфизм;
IRAP - Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism;
REMAP - Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism.

Van De Sluis B et al, 2002, в ходе исследований установили, что расстояние между мутацией MURR1 и C04107 маркером составляет примерно 8 килобайт, что является чрезвычайно близким и, казалось бы, делает C04107 маркер прекрасным маркером для прогнозирования CT.
Однако имеются сообщения о рекомбинации между мутацией и C04107 (Haywood et al. 2001 ; Holmes et al. 1998 ). Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов.
Несмотря на высокую популярность микросателлитов, они имеют и некоторые недостатки. Неравномерность скорости мутирования разных микросателлитов создает определенные сложности для популяционно-генетического анализа.

Классификация ДНК-маркеров до сих пор не сформирована, что объясняется не только их многообразием, но и тем, что при введении тех или иных модификаций в известный метод, авторы часто дают новое наименование получаемым ими маркерам (C04107, C04107В).

Прямой генетический метод ДНК-тестирования
Группа ученых из Нидерландов (Van De Sluis B et al, 2002) провела картирование гена СТ у бедлингтон терьеров. Ген был локализован на хромосоме 10 (10q26), установлена протяженность гена: < 500 kb. Оказалось, что в обоих аллелях больных животных и в единственном аллеле, обязательно присутствующем у носителя заболевания, отсутствует делеция) экзон 2 в гене MURR1, а именно отсутствие 94 аминокислот.
Это открытие – локализация мутации, ведущей к развитию заболевания СТ, имеет особое значение для разделения больных собак от носителей и здоровых терьеров Bedlington, чтобы иметь возможность разводить бедлингтонов, свободных от СТ.

Таблица 10
Возможные генотипы при различных методиках ДНК-тестирования

Тип маркера C04107
Интерпретация
Тип маркера C04107В
Интерпретация
MURR1-del
Делеции
1-1
здоровый
a-a
здоровый
n.n.
Не несет делеций (здоровый)
1-1
здоровый
a-c
здоровый/мутированный здоровый
n.n.
Не несет делеций (здоровый)
1-1
здоровый
c-c
мутированный здоровый/мутированный здоровый
n.n.
Не несет делеций (здоровый)
1-2
носитель
a-b
носитель
n.del.
Носитель одной копии делеции
1-2
носитель
a-b
носитель
n.del.
Носитель одной копии делеции
2-2
больной
b-b
больной
del.del.
Несет две копии делеций (больной)

Имеются сообщения о рекомбинации между мутацией и C04107 ( Haywood et al. 2001 ; Holmes et al. 1998; van de Sluis et al. 2002).
Чтобы изучить происхождение этого возможного случая рекомбинации между C04107 маркером и делецией экзона 2 MURR1 была исследована кровь семьи из шести здоровых бедлингтон терьеров (из популяции бедлингтонов США): родители и помет из четырех щенков.
Хотя у этих собак имелся нормальный фенотип (все внешне здоровые), они несут аллель C04107 2, который обусловливает развитие СТ :

Все они были здоровые гомозиготы с генотипом 2-2 или 1-2 по C04107 маркеру (непрямой ДНК-тест)

Таблица 11
Конкретный пример гаплотипов семьи американских бедлингтонов,
вошедший в сферу исследований авторов статьи:

Отец
гомозиготен
2-2
здоровый
Мать
гетерозиготна
1-2
носитель
щенок 1
гомозиготный
2-2
здоровый
щенок 2
гетерозиготен
1-2
носитель

*) Гистология показала нормальную архитектуру печени. Концентрация меди в биоптатах у родителей была в пределах нормы. Возраст щенков на момент исследования не достигал возраста 1 года, поэтому биопсия печени была не целесообразна (общепризнано, что диагностика СТ по биопсии в возрасте менее 1 года не является достоверной, Rothuizen et al., 1999). Помет был включен в молекулярный анализ для определения генотипа и установления гаплотипа.

Прямой генетический метод (MURR1) показал, что отец был гомозиготен по аллелю «дикого типа» (WT=”n.n.”), а мать была гетерозиготна (“n.del”).
Анализ гаплотипа (методика опускается за рамки настоящего сообщения), протяженностью около 600 кб, выявил новый гаплотип (гаплотип «С»), содержащий C04107 маркер в аллеле 2 в комбинации WT MURR1 аллели. Анализ различных маркеров дал возможность предположить, что в популяции бедлингтон терьера существуют различные генетические фоны. Хотя гаплотип «C» содержит аллель 2 по маркеру C04107, он не содержит мутацию MURR1 и, поэтому, не связан с увеличенным риском развития СТ.
Авторы высказали предположение, что учитывая высокую степень межродственного скрещивания, вероятно, что у всех бедлингтон терьеров, страдающих медным токсикозом, имеется та же самая мутация, унаследованная от общего предка.
Yuzbasiyan-Gurkan et al. (1997) использовали семь родословных бедлингтонов для начальной идентификации связанного с СТ маркера C04107. В этих семи родословных с 21 здоровыми собаками имели ДНК 2-2 для маркера C04107.

Таблица 12
Конкретный пример гаплотипов семьи американских бедлингтонов, вошедший в сферу исследований авторов статьи:

 
 
 
Тип маркера C04107
 
Тип маркера C04107B
Отец
гомозиготен
2-2
здоровый
гаплотип С
с-с - здоровый
Мать
гетерозиготна
1-2
носитель
гаплотип В
b-с – носитель
потомки
гомозиготны
2-2
здоровые
гаплотип С
с-с - здоровый
потомки
гетерозиготны
1-2
носитель
гаплотип В
b-c - носитель

Таким образом, в настоящее время единственным надежным диагностическим тестом является анализ мутации (делеция) в экзоне 2 гена MURR1 – прямой генетический метод диагностики СТ.

  Далее см. Часть 2

 

Copyright © 2002 - 2014 Kennel  "SOLO ROSSII"